碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定.docx

优质范文 优质范文 碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常 数测定 一、实验原理 .碱性磷酸酶的分离纯化 机械破碎法制备肝匀浆 低浓度乙酸钠：低渗破膜 低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP 有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33%丙酮、30沱醇：溶解AKP 50%^酮、60%^醇：沉淀 AKP .比活性测定 比活性的定义 *单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 *通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 *用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一 测定样品的比活性必须测定： *每毫升样品中的酶活性单位数。 *每毫升样品中的蛋白质毫克数。 磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理 NaO h3 XIH Na O h3 XI H TOC \o 1-5 \h \z CSHS CSHS * I I 办 N N [汁+心八.0-^+心/ \ -0 \o Current Document V If ? ft I [ /=\ c H3c-N一: C-NHj H￡ —C—NHy—0 4一氨基安替比林 醞衍生物 - .米氏常数测定 Vm*i * [S] 』Km^R[sr Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度 兴如上式表示，米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度 ， 因此， 米氏常数的单位为mol/L。 当反应速度等于最大速度一半时 ，即V二1/2 Vmax, Km = [S] 兴吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。 以吸光度的倒数作纵坐 标， 以底物浓度的倒数作横坐标，按 Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。 1 1 _ ] 优质范文 优质范文 器材 台式离心机 恒温水浴锅 微量移液721分光光度计 台式离心机 恒温水浴锅 微量移液 器 匀浆器 试管托盘天平 匀浆器 试管 试齐I」 1. 0.5mol/L 醋酸镁溶液 称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水 稀释至50ml. 2. 0.1mol/L 醋酸钠溶液 称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水 优质范文 优质范文 稀释至10ml. 0.01mol/L 醋酸镁---醋酸钠溶液 取0.5mol/L醋酸镁溶液 2ml 及O.1mol/L醋酸钠溶溶液 10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至 100ml. 丙酮（分析纯）. 95沱醇（分析纯）. Tris 缓冲液（Ph8.8） 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成 50ml,为 0.1mol/L Tris 液,取 0.1mol/L Tris 液 10ml,加 0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水 稀释至100ml. 0.01mol/L 基质液 称取磷酸苯二钠 （QHsPONsr. 2H2O） 0.3g, 4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中；两液混 合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中，冰箱内 保存,可用一星期；临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液 混合即可. 0.1mol/L pH10 的碳酸盐缓冲液 称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水，稀释至50ml. 碱性溶液 量取0.5mol/L氢氧化钠溶液 与0.5mol/L碳酸氢 钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml. 0.5% 铁氰化钾溶液 称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各 溶于20ml蒸馏水中，溶解后两液混合均匀，再加蒸馏水至50ml, 置棕色瓶中暗处保存. O.1mol/L 醋酸镁溶液 称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中， 稀释至10ml. 酚标准液(0.1mg/ml). 实验步骤 (1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作 2月蠻肝剪碎 置于玻璃匀浆管中曲0.01 mol/L醋嚴钱乜01 mol/L酷 V酸纳溶液6 在匀浆器上匀浆J0 000小叫丨分帥3 肝匀浆 沉淀（弃去）上清械倒人刻度离心管「记录体枳仇液）（约8 ml）.吸出A液0」ini置于另一试管中,在比试管中加4.9 ml pH 8TrisS冲液（A‘管）节测比活性用。然后在A般中加2 ml正丁醇?用玻楼充分搅拌3d分钟5随后室温故置30分种「单层滤纸过滤,取滤義，加等体积冷丙St混匀*2 000 rpni离心5分钟。 沉淀（弃去）上清械 加0.5 mol/L酣酸扶4 mllB液L记录II枳、取B液0J同阻F另一试管中■加4.9 ml pH 8.8 Trk缓冲液（R管），待洒比活性用。 + 95%冷乙停至60%哟4.3 mk混匀,2 500 ipm离心5分钟」 上清液（弃去）沉淀 加05n?l/L雷酸篌3 ml溶解，记录休税（C涼）?取C液0」ml 咒于另一试曽中』II 2.0 ml