10.医学前后对照实验设计例子.docx

PAGE PAGE 1 医学前后对照实验设计例子 《医学免疫学》实验设计 期别：xxx班级：xx学号：xxxxxxxx 姓名：OOO IL-35对小鼠I型糖尿病的治疗效果及免疫机制 【立题依据】 自身免疫性疾病(Autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。如今越来越多的自身免疫性疾病被不断发现和认识，也越来越引起人们的关注。I型糖尿病（TIDM自身免疫性胰腺炎）就是其中的一员，在全球大约有2000万患者，中国至少有100万的患者，但是I型糖尿病常常在幼儿和青少年时期发生且为一种多基因遗传病有较高的遗传度（75%），表现为明显的家族遗传性。同时，I型糖尿病患者如治疗不善将引发严重的并发症，如失明、肾衰竭、心脏病、截肢等。因此如果能正确了解I型糖尿病的免疫学机制，并探索更加有效治疗及预防方案，对于患者本身乃至整个家族的身体和生活质量的提高意义重大。 I型糖尿病的免疫学发病机制是体内除了抗原提呈细胞（APC）和活化的T淋巴细胞外正常细胞几乎不表达MHC-II类分子，研究表明IFN-Y转基因小鼠的胰岛β细胞分泌IFN-Y，由于IFN-Y刺激MHC-IⅡ分子的表达这种小鼠的胰岛细胞高表达MHC-IⅡ类分子，这样以来免疫细胞就会结合并识别胰岛β细胞然后对其进行攻击，使其丧失胰岛素分泌活性，最终导致体内胰岛素缺乏。调节性T细胞（Treg）是一些CD4Tcell还可高表达IL-2受体的a链（CD25）分子，胞质中表达Foxp3转录因子的T细胞分化亚群。它的主要功能是通过抑制CD4*Teell和CD8*Teell的活化与增殖从而达到免疫的负调节作用。通过协调Treg水平来调节I型糖尿病患者的免疫功能可能成为新的治疗手段。 白细胞介素-35（IL-35）是2007年新发现的一种独特的具有免疫抑制功能的调节因子，属于IL-12细胞因子家族，IL-35为异源二聚，主要由活化的Treg分泌，对多种免疫细胞和细胞因子均有明显的抑制作用，参与介导机体免疫耐受的形成。L-35是否对1型糖尿病患者具有治疗作用及其相关的免疫机制，还不十分清楚，仍有待继续研究和解决。 【实验目的】 本实验就是通过提高NOD系小鼠（I型糖尿病患鼠）体内的IL-35水平，观测小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的I型糖尿病发病率、胰岛炎评分等，评定L-35对I型糖尿病的预防及治疗效果，并与其它一些免疫抑制性的药物（环孢菌素A）等，进行药敏对比：同时，体外测定小鼠体内IL-4及干扰素-Y（IFN-Y）的等含量及调节性T淋巴细胞的含量等，对小鼠的免疫体质及L-35对I型糖尿病作用的免疫学机制有大体认识及方向把握，为以后的研究打下基础。从而为新药（联合药）的开发，免疫抑制领域的深入研究有一定意义。 【实验对象】 NOD系I型糖尿病鼠和NON系正常不患病鼠（雌性4周龄）起源在对ICR/Jcl小鼠进行近郊培育的第6代，从白内障易感亚系分离出非肥胖糖尿病品系（NOD）和非肥胖正常品系（NON）。在近交20代时，首先发现NOD雌鼠有胰岛素依赖性糖尿病。 特征：自发I型糖尿病以及多种自身免疫疾病小鼠。通过病理学观察发现，NOD小鼠自身免疫性胰岛炎发生于4周龄。NOD小鼠发病后，充分呈现该品系小鼠糖尿病的生理生化特 征即：尿频·多饮·高血糖症状。在几周的时间内，血糖迅速升高，饮水量剧增，大量的排尿，体重迅速下降，在这个过程中，患鼠血糖呈现迅速上升，后逐步下降，但仍维持高于正常值的状态，体重直线下降，最后昏迷而死亡。于12周龄时出现明显糖尿病症状，至30周龄时雌性小鼠累计发病率可达到80%。 【实验材料】 试剂及仪器IL-35试剂，磷酸盐缓冲液（PBS），酶联免疫吸附试验（EISA）试剂盒，流式细胞仪，CD8及CD4单克隆抗体，注射器等基础实验器械。 【实验方法及步骤】 1.小鼠的分组与处理 选取NOD系I型糖尿病鼠20只和NON系正常不患病鼠10只，分为三组。10只NOD系小鼠作为实验组，10只NOD系小鼠作为实验对照组，10只NON系正常不患病鼠作为正常对照组。对各组四周龄小鼠采取：实验组注射L-35注射液，每三天注射一次，注射量根据生物试剂公司提供的L-35试剂说明书为准，连续注射7周；实验对照组和正常对照组注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS），注射方式同实验组。各组小鼠自由饮食，饮水不限。 2.糖尿病及体重检测 从各组小鼠10周龄开始每周记录体重，每天采取断尾方式测血糖含量和尿糖含量，血糖连续2天超过16.00mmol/L即诊断为糖尿病，30周后观察期满终止观察，计算各组小鼠发病率： 3.胰腺炎严重程度评分 30周后，颈椎脱白法处死各组小鼠，取各组小鼠胰岛做HE染色切片进行病理性胰岛炎评分：0级：胰岛完整无淋巴细胞浸润，计0分：1级：