第二章基因工程制药新版2.ppt

特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响λphage裂解生长的能力。 包装限制： λphage头部外壳蛋白容纳DNA能力上限≤105%，下限≥75%。包装范围[51kb, 36kb].只有λDNA的长度大于野生型λphage DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成phage颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，phage活性就急剧下降，故要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在36～51kb之间。 λ载体必要区是28kb,理论上克隆能力为23kb. （B） 改造酶切位点 野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。 （C） 增加选择标记 （5）常用的细菌质粒 pBR322 pBH10 pBH20 pTR262 pAT153 pXf3 Pmk16 pGEM-3Z pUC19 [A]、pBR322质粒 [B]、pUC19质粒 [C]、pGEM-3Z 质粒 [A]、 pBR322质粒 ① 4363 bp ② 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因(ampR) ④ 一个抗四环素基因 (tetR) ⑤ ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外源基因插入抗药基因内，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS). pBR322:人工构建重要质粒 优点：具有较小的分子量． 　　　具有两种抗生素抗性基因，作为筛选标记． 　　　具有高拷贝数． 　　　是松弛型质粒． [B]、 pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampR和位于lacZ+ 基因中靠近5’端多克隆位点(MCS)和来源于pBR322质粒的复制起始点 （3）大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ+基因，便于蓝白筛选 pUC质粒优点： 　　１．具有更小的分子，更高的拷数 　　２．适于组织化学检测重组体． 　　 [C]、 pGEM-3Z质粒 含一个ampR基因和一个lacZ’编码基因; 有多克隆位点（MCS）; 正选择颜色标记 lacZ’; 有两个来自噬菌体的强启动子PT7和PSP6,用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等 2743 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr pGEM-3Z PSP6 2、真核基因病毒DNA （1）病毒载体的优点 （2）已经研究的真核基因病毒DNA （1）病毒载体的优点 [A]、具有很高的拷贝数量。 [B]、有强大的启动子。 [C]、可保证目的基因的高效表达。 （2）已经研究的真核基因病毒DNA [A]、SV40病毒DNA [B]、牛乳头瘤病毒 [C]、RNA病毒 [D]、昆虫杆状病毒 [E]、人痘病毒DNA [F]、猴空泡病毒DNA [G]、人腺病毒DNA [H]、人牛痘病毒DNA [ I ]、逆转录病毒载体 [A]、SV40病毒DNA （A1）、 SV40病毒DNA的特性 （A2）、SV40病毒DNA的基因组 （A3）、SV40病毒DNA载体的构建 （A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法 （A1）、SV40病毒DNA的特性 为环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。 SV40病毒有二种表达方式：（1）游离表达方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。（2）结合表达方式，重组DNA整合到宿主染色体的DNA之中，与染色体基因一起表达。 （A2）、SV40病毒DNA的基因组 （A3）、SV40病毒DNA载体的构建 （A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法 [G]、腺病毒 （G1）、腺病毒DNA载体 （G2）、腺病毒DNA载体的特点 3、λ噬菌体DNA （1） λ噬菌体DNA的特性 （2） λ噬菌体DNA的改造 （3） λ噬菌体DNA的体外包装 （4） λ噬菌体载体的构建 （5） λ噬菌体载体的使用 （6） λ噬菌体载体的优点 （1）λ噬菌体DNA的特性 λ噬菌体DNA为双链的DNA病毒，宿主是大肠杆菌。 已发现λ噬菌体DNA可编码61个基因。 [A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式 [B]、λ噬菌体DNA的结构 [A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式 （