核酸分子杂交技术和生物芯片技术——【分子诊断学】.pptx

第六章;第一节 核酸分子杂交;核酸－变性;核酸－变性;核酸－变性;核酸－变性;核酸－复性;核酸－复性;核酸分子－杂交;;核酸分子杂交;核酸分子杂交分类;核酸分子杂交分类;核酸分子杂交;核酸分子杂交－固相支持物;膜印迹方法－毛细管转移;ssc;;接真空泵;Southern印迹杂交; 在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。;斑点/狭缝印迹杂交;菌落原位杂交;原位杂交;荧光原位杂交;探针DNA;第二节 核酸探针;核酸探针;核酸探针的标记;放射性标记物;非放射性标记物;核酸探针的标记方法;核酸探针的标记方法;核酸探针的标记方法;核酸探针的标记方法;核酸探针的标记方法;核酸探针的标记方法;乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质。 凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用， 将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及 寡核苷酸(<80bp)等物质分离。 ;核酸杂交的信号检测－放射性核素探针;核酸杂交的信号检测－放射性核素探针 ;核酸杂交的信号检测－非放射性核素探针 ;偶联反应;显色反应;;第七章;第一节 生物芯片; 生物芯片;生物芯片;应用 ;第二节 DNA芯片;DNA芯片制备;原位合成法;光导原位合成法;直接点样法;样品的制备;杂交与杂交信号检测;DNA芯片的临床应用 ;第二节 蛋白质芯片;蛋白检测芯片---- 将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用于识别复杂生物样品中的目标蛋白/多肽。根据检测方法,不同蛋白质检测芯片又可进一步分为正相蛋白质检测芯片和反相蛋白质检测芯片。?;蛋白功能芯片----天然蛋白点加在基片上，了解体系中哪种蛋白能与已知的某种蛋白结合，用于天然蛋白活性及分子亲和性研究。;2.探针预处理 蛋白质探针的性质差异很大，稳定性也差，通常用来制备芯片的蛋白质最好具有较高的纯度和完好的生物活性，所以点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解。一般是采用含40％甘油的PBS缓冲液，一则可以防止溶液蒸发，使蛋白质在芯片的整个制作过程中均保持水合状态；再则该缓冲液可有效防止蛋白质变性，从而维持其生物活性??; 在点样前，一般先对载体表面进行化学修饰，使其表面富含氨基并带正电。修饰后的固相载体表面利用静电吸附带负电的蛋白质探针，或通过双功能偶联试剂(如戊二醛)辅助形成共价化学键而连接。蛋白质芯片常用载体有膜载体和载玻片。膜载体常用聚偏二氟乙烯膜，用95％乙醇浸泡处理。以载玻片作为载体时，通常用含乙醛的硅烷试剂处理载玻片，使载玻片表面带有活性醛基基团，醛基与蛋白质所带的氨基反应将蛋白质固定在载体上，这种方法适合固定较大的蛋白质分子。若固定较小的蛋白质分子或肽，则用小牛血清白蛋白-琥珀酰亚胺修饰载玻片，与待固定蛋白质的氨基或羧基发生反应，形成共价连接。;直接点样方式由于其操作简便、成本低、易于推广等优点而广泛地被采用。自动化仪器有一套计算机控制的三维移动装置，包括装点样针的点样头、机械手臂、点样针清洗系统、芯片载片台及计算机控制系统。接触点样和喷墨点样。 点样后处理：通常情况下，点样后处理包括水合、紫外交联、洗脱和封闭4个步骤。水合的目的是保证样品与基片表面在溶液状态下充分反应；紫外交联的目的则是希望样品与基片表面形成的化学键能够吸收紫外线而变得更加牢固；洗脱的目的是为了洗掉那些没有牢固结合的样品，以消除其在杂交过程中的影响；封闭则是为了消除基片表面活性基团与杂交液中的探针分子之间的非专一性相互作用而产生背景。;操作;间接检测法 ?预先用标记物进行标记，标记物主要包括荧光物质、化学发光物质、酶及同位素等。应用最广的是荧光染料标记，用激光扫描和CCD照相技术对激发的荧光信号检测，再用计算机和相应的软件系统进行分析。其突出优点就是简捷、直观，不足之处在于易产生蛋白质间的非特异性作用，且标记物的加入可能会降低分析的准确度。 直接检测法 因为标记分子有可能会影响蛋白质活性，作为直接检测法的无标记模式，如质谱技术、表面等离子共振技术、光学蛋白质芯片技术、原子力显微镜等在蛋白质天然活性检测方面有着特别的优势。;特异性抗原抗体的检测 生化反应的检测 疾病诊断 对疾病分子机制的研究 药物筛选及新药的研制开发 ;芯片实验室;芯片实验室;芯片实验室;谢谢!;