克隆基因的表达.ppt

12N6愈伤诱导2N6-BA预培养3N6-H选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程4植株再生第53页,共57页，2024年2月25日，星期天第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细胞中的表达第54页,共57页，2024年2月25日，星期天第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素第55页,共57页，2024年2月25日，星期天第二节原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子第56页,共57页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第57页,共57页，2024年2月25日，星期天****正确翻译的基本条件1、具备起始密码子2、具备终止密码子3、具有正确的阅读框第21页,共57页，2024年2月25日，星期天基因表达的基本过程第22页,共57页，2024年2月25日，星期天第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素第23页,共57页，2024年2月25日，星期天4、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录其始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TTGACA)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，故称为-35区，5’--TATAAT)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。第24页,共57页，2024年2月25日，星期天b.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----16SrRNA3’末端第25页,共57页，2024年2月25日，星期天c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA第26页,共57页，2024年2月25日，星期天第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细胞中的表达第27页,共57页，2024年2月25日，星期天第二节原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子第28页,共57页，2024年2月25日，星期天一、原核表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；真核基因转录的mRNA缺乏SD序列，在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。第29页,共57页，2024年2月25日，星期天二、构建原核表达载体的策略将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决