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原代肿瘤细胞的分离培养
实验目的:从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞
实验器材:新鲜人体乳腺癌组织
胶原酶(Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基,浓度1mg/ml),DMEM培养
基,胎牛血清,PBS,双抗(青链霉素,100×)
手术器械,培养皿,培养瓶,离心管,恒温摇床,离心机,倒置显微镜,细胞培
养箱
实验原理:
酶消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状),应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥
连结构松动,使团块膨松,由块状变成絮状,此时再采用机械法,用吸管吹打分散或电磁搅
拌或在摇珠瓶中振荡,使细胞团块得以较充分的分散,制成少量细胞群团和大量单个细胞的
细胞悬液,接种培养后,细胞容易贴壁生长。
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶是一种胰脏制品,主要作用于赖氨
酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开,适于消化细胞间质
较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。胶原酶是一
种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用,适于消化纤维性组织、上皮组织以及
癌组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等,它对细胞间质有较好的消化作用,
对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。
本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化,以获取原代乳腺癌细胞。
实验步骤:
1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中,加入适量PBS,使用眼科镊和眼科剪去除组织上的
血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,保留肿瘤细胞丰富的区域,并用PBS清
洗两遍。
2.将癌组织放入新的培养皿中,加入少量DMEM培养基,使用眼科剪将组织剪成约1mm3
大小的碎块。
3.转入15ml离心管中,用PBS冲洗数遍,组织块自动下沉后,除去PBS。
4.将组织块转入培养瓶中,加入5ml胶原酶和双抗(稀释至2×),吹散组织碎块,置于3
7℃恒温摇床上消化组织,调节速度150r/min,每隔30min于镜下观察一次。
5.待组织块镜下透光性良好,呈絮状时,转入15ml离心管中,1300r/min离心5min,弃上
清。
6.加入PBS洗涤数次,反复吹打后,1300r/min离心5min,弃上清。
7.加入DMEM完全培养基(含1×双抗),反复吹打,转入培养皿中,镜下可见单个细胞
及细胞团,细胞培养箱培养。
注意事项:
1.全程严格无菌操作。
2.取材要注意新鲜和保鲜。
3.取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,尽可能减少对细胞的机械损伤,切碎组织时
应避免组织干燥。
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4.若组织在消化时间较长时仍未散开,可采用多次提取消化法以减少酶对已消化下来的细
胞的损伤。
活细胞工作站分析技术
一、本显微镜主要观察方法简介
明场:适合常规镜检、病理、染色样品的观察方法。此观察方法优点是视野亮度高、均匀,
应用范围广,操作简单。缺点是:透明标本对比度低,标本没有立体感。
相差:利用被检物体的光程(折射率x厚度)差进行镜检,即利用干涉现象,将相位差变为
人眼可以分辨的振幅差。鉴定活体细胞最实用、最经济的方法。
荧光:物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态,再回到低能状态时释放出的
光,是非温度辐射光——冷光。即:物质吸收短波光,发射出的长波光。荧光显微镜利用荧
光光源激发样品中的荧光物质,检测激发光的情况
以上各种观察方法配合活细胞孵育装置,即可完成对活细胞的各种观察要求。活细胞孵
育装置通过软件或TFT触摸屏中Incubation模块进行精细的调节。
二、系统开关机
开机顺序
1.打开显微镜电源总开关
2.打开显微镜开关
3.拍荧光时打开荧光光源
4.打开电脑及软件
关机顺序
先关软件,然后是荧光光源、显微镜开关、电源开关!!
三、明场观察成像操作流程
1.开总电源,显微镜开关(“ON/OFF”)孵育装置及电脑
2.打开卤素灯的光闸“TL”使光线透过聚光镜穿透样品
3.调节光强,光路100%转到眼睛
4.聚光镜打到H位
5.反射镜转轮打到BF明场位置
6.低倍(如10X倍)下观察样品,通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置,并通过粗细调
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