琼脂糖电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 要改 浙江中医药大学.ppt

琼脂糖电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 浙江中医药大学生命科学学院 生化教研室 LD NAD++乳酸 丙酮酸+ NADH 吩嗪二甲脂硫酸盐（PMS） NADH 氯化碘代硝基唑蓝（INI） 还原为紫红色的甲（zhan）化合物 有LD活性的区带就会显紫红色且颜色深浅与酶活性成正比。 * * 【实验目的】 掌握：电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶 的基本原理。 熟悉：电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶 的操作过程。 了解：血清乳酸脱氢酶同工酶测定对疾病 诊断的临床意义。 【实验原理】 能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶，LD同工酶的一级结构是由两种不同亚基(M、H)组成的四聚体，形成5种结构不同的同工酶，其中H型亚基中酸性氨基酸较多，电泳时负电荷多，因此电泳速率较快。按电泳向阳极泳动快慢，分别命名为LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)，在一定的电泳条件下，使其在支持介质琼脂糖上分离，然后利用酶的催化反应进行显色。 【实验原理】 以乳酸钠作为底物，LD催化乳酸脱氢生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）将NADH的氢传递给氯化碘代硝基四唑蓝（INT），使其还原为紫红色的甲臜化合物。有LD活性的区带就会显紫红色，且颜色深浅与酶活性成正比，利用光密度仪或扫描仪可求出各同工酶的相对含量。 【实验原理】 由于同工酶在不同组织、器官中的分布不同，即具有组织器官特异性，比LD总活性的测定临床意义大。因此已利用同工酶的酶谱作临床诊断的依据，也被利用于生物分类及遗传育种等工作中。 【试剂及器材】 1. 0.082mol/l巴比妥-HCl缓冲液（pH8.2）：溶17.0g巴比妥钠溶于蒸馏水中，加入1mol·L-1 HCl溶液24.6ml，再加蒸馏水至1000ml。 ---用于凝胶配制。 2. 巴比妥缓冲液（pH8.6，0.075mol·L-1）：巴比妥钠15.458g、巴比妥2.768g溶于蒸馏水，加热助溶，冷却后定容至1000ml。---用于电泳。 3. 10mmol·L-1?EDTA·Na2（乙二胺四乙酸钠盐）溶液：称取EDTA·Na2 372mg，溶于蒸馏水并稀释至100ml。 4. 5g/L琼脂糖凝胶：溶0.5g琼脂糖于50ml巴比妥-HCl缓冲液（pH8.2），再加?EDTA·Na2溶液1.2ml,和蒸馏水48.8ml，隔水煮沸溶解，不时摇匀，趁热分装到大试管中，冷后用塑料管密封管口置冰箱备用。 5. 8g/L琼脂糖染色胶：溶0.8g琼脂糖于50ml巴比妥-?HCl缓冲液（pH8.2），加蒸馏水48ml，待琼脂糖溶化后，再加0.01mol/L?EDTA·Na2溶液2ml，冰箱保存备用。 6.显色试剂： （1）DL-乳酸溶液：取85%乳酸（AR）2ml，用1mol/L NaOH调PH至中性（约用23.6ml） （2）1g/LPMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）：称取50mgPMS，加蒸馏水50ml溶解。 （3）10g/L NAD+：称取100mg NAD+溶解于10ml新鲜蒸馏水中。 （4）1 g/L氯化碘代硝基四唑蓝（INT）：称取30mgINT，溶解于30ml蒸馏水中。 上述试剂需要贮存于棕色瓶中，置4℃保存。除10g/L NAD+外，其余均可保存3个月以上。 （5)底物-显色液（现用现配）取上述各试剂按下列比例混合而成： 取乳酸溶液4.5ml，PMS液1.2ml，NAD+液4.5ml（或NAD+45mg溶解于4.5ml蒸馏水中），INT液12.0ml.将上述4液混匀，共22.2ml.7.固定漂洗液：按乙醇：水：冰醋酸=14：5：1（V/V/V）的比例混合，或按95%乙醇：冰醋酸=98：2的比例混合而成。8.电泳仪、电泳槽 【操作步骤】 （一）琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶。 1.琼脂糖凝胶板的制备：将5g/L琼脂糖凝胶沸水浴加温熔化。取2ml熔化的凝胶液平浇于一洁净的载玻片上（载玻片放在水平台上，载玻片的大小为8×2.5cm）。冷却时在距离一端2cm处加白色塑料板，待凝固后，取出塑料板，形成点样槽，滤纸吸干槽内水分。 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 点样槽 2.加样：用微量注射器向小槽内加入新鲜血清20-40μl。 3.电泳：将凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳缓冲液的滤纸或纱布作盐桥，点样端靠近阴极。电压约75-100V，电流8-10 mA /片，电泳30—40分钟，待血清白蛋白