《生物技术概论》第3章3.6杂交育种.ppt

诱变剂 剂量 原生质体诱变 孢子诱变 正变率 负变率 正变率 负变率 UV/min 10 14.0 26.0 - 9.0 20 19.0 30.0 3.0 14.0 30 3.0 32.0 4.0 22.0 60Co-γ/rad 8000 25.0 23.0 - 20.3 16000 16.0 20.0 7.0 21.0 24000 18.0 15.0 12.0 26.0 48000 - 37.0 14.0 25.0 He-Ne激光/min 2 11.0 9.0 - 6.8 5 11.0 17.0 - 6.8 10 10.0 16.0 0 7.0 25 11.0 4.0 3.0 11.0 几种诱变剂对扩展青霉PF-868原生质体的诱变效应 项目 原生质体 孢子 细胞结构 无细胞壁 致密细胞壁 细胞状态 对数生长期，菌体代谢旺盛 休眠期，菌体代谢缓慢 对诱变剂敏感程度 强 弱 诱变剂作用速度 快 慢 诱变效果 突变频率高，正变率高 突变频率低，负变率高 原生质体诱变与孢子诱变比较 出发菌株的选择 菌种活化和预培养 原生质体再生 复筛 遗传稳定性鉴定 原生质体制备 高产菌株分离（初筛） 菌种特性及发酵特性研究 原生质体诱变育种的一般过程 使用诱变剂对原生质体悬浮液进行诱变处理 3、原生质体转化育种 通过转化，将质粒DNA或染色体DNA、片段DNA转入原生质体的技术。 影响转化的因素： PEG的来源、批号、聚合度； 制备原生质体的菌龄，菌丝的生长条件； 转化的原生质体和质粒的浓度； 原生质体再生条件，再生培养基组成等。 出发菌株的选择 菌种活化和预培养 原生质体再生 复筛 遗传稳定性鉴定 原生质体制备 高产菌株分离（初筛） 菌种特性及发酵特性研究 原生质体转化育种的一般过程 质粒及原生质体以一定比例混合，在PEG介导下完成转化过程 第三章 菌种选育的理论与技术 第五节 原生质体融合育种 原生质体融合育种 原生质体融合育种是指将两个基因型不同的菌株经原生质体融合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状菌株的过程。 特点 大幅提高亲本之间的重组频率； 扩大重组的亲本范围； 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状机会更大。 原生质体融合育种的一般过程 选定纯化亲本 B 再生培养基 长出菌落 融合子的分离和融合重组体的鉴定 选定纯化亲本 A 亲本A加标记 原生质体融合 检出融合子 原生质体 A 亲本B加标记 原生质体 B 一、直接亲本及其遗传标记的选择 1、灭活标记 是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化而失去再生的能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。 灭活原则 灭活条件应适当温和，使细胞杀死，但保持DNA的遗传功能和重组功能。 钝化原生质体 A 单一亲株灭活示意图 55℃ 30min 原生质体 A （野生型） 再生M 原生质体 B （营养缺陷型、Strr） 筛选 （+） （-） 再生M 原养型重组体 （80%Strr） 2、荧光标记 是一种非人工遗传标记。在双亲原生质体悬浮液中分别加入不同的荧光色素，离心除去多余染料后，将带有不同荧光色素的亲本原生质体融合，然后挑选同时具有双亲染色的两种荧光色素的融合体。 二、原生质体的制备 （一）原生质体的制备过程 斜面孢子 接种 液体培养基 离心 收集菌丝 高渗溶液 酶解 原生质体 （二）影响原生质体制备的因素 1、培养基 甘氨酸：替代D-丙氨酸，错误掺入四肽尾中，干扰细胞壁肽聚糖的交联，使细胞壁结构疏松，利于原生质体形成。 EDTA：能与多种金属离子形成络合物， 避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。 青霉素：松动细胞壁中的蛋白质结构，增加细胞壁对脱壁酶的敏感性，更有利于原生质体的形成。 2、菌龄 培养至对数生长期，或培养至对数生长期到静止期的转换期。 5、酶解温度和pH 控制适合的酶解温度和pH。 3、酶的种类 细 菌：蛋清溶菌酶 放线菌：蛋清溶菌酶 酵 母： 蜗牛酶 真 菌：几丁质酶，纤维素酶 4、酶浓度 选择利于原生质体形成和再生的酶浓度。 6、酶解时间 控制适合的酶解时间。 7、酶解方式 在酶解过程中要经常轻微摇动混合液，这样不仅能使菌体不断接触新鲜酶液，而且又能补充氧气，保持良好的通气条件，有利于正常的生理活动，这对原生质体释放数量和活性都是有益的。 8、渗透压稳定剂 原生质体必须在高渗或等渗的溶液或培养基中才能维持生存。 细菌或放线菌：蔗糖、丁二酸钠等； 酵母菌：山梨醇、甘露醇等； 霉菌：KCl和N