桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化_图文.doc

　2009; 35(2 蚕　业　科　学　　　CAN Y E KEXUE 收稿日期:2008-03-26 资助项目:河北省强势特色学科桑天牛成虫肠道细菌多样性研究项 目(编号2008013 。 作者简介:袁秀洁(1982- , 女, 河北, 硕士研究生。 Tel E 2mail:yuanxiujie w@yahoo . cn 通讯作者:李会平, 博士, 副教授。 Tel E 2mail:hui p ingli@s ohu . com 黄大庄, 教授, 博士生导师。 Tel:031227528718, E 2mail:huangdazhuang@163.com 桑天牛成虫肠道细菌基因组D NA 的提取及PCR 反应体系优化 袁秀洁　李会平　黄大庄　黄秋娴　苏筱雨　侯晓杰 (河北农业大学, 河北保定　071000 摘　要　为了建立一套适用于桑天牛肠道细菌多样性研究的PCR 反应体系和程序, 采用改良的十六烷基三乙基溴化铵(CT AB 法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA, 通过L 16(45 正交组合试验和单因素梯度试验对MgCl 2、 d NTP 、随机引物、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR 扩增的重要因素进行优化。 试验结果表明, 采用改良的CT AB 方法提取的桑天牛成虫肠道细菌DNA , 适宜于。25μL PCR 反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer 215200随机引物0148μmol/L,Taq DNA 聚合酶0175U, 模板DNA , 关键词　桑天牛; ; 中图分类号. . 　B 　　　文章编号　0257-4799(2009 02-0379-05 m i c DNA Extracti on and Optim i zati on of PCR Reacti on Syste m of Apriona germ a ri I ntesti n al Bacter i a Y UAN Xiu 2J ie 　L I Hui 2Ping 3　HUANG Da 2Zhuang 3 　HUANG Q iu 2Xian S U Xiao 2Yu 　HOU Xiao 2J ie (H e b e i A g ric u ltu ra l U n ive rs ity, B a od ing H e b e i 071000, C h ina A b s tra c t 　In o rd e r to e s ta b lis h op ti m a l PCR (p o lym e ra s e c ha i n re a c ti on s ys tem a nd p roc e d u re fo r s tud ying the d ive rs ity of Ap riona g e r m a ri in te s ti na l b a c te ria, a m od ifi e d C T AB (he xa d e c yl tri m e thyl am m on ium b rom i d e m e thod w a s em p l oye d to e xtra c t g e nom ic DNA of the Ap riona g e r m a ri i n te s tina l b a c te ria. S e ve ra l i m p o rta n t fa c to rs i nc lud ing M gC l 2, dN TP, ra nd om p ri m e r, Ta q p o lym e ra s e a nd tem p la te DNA w e re op ti m i ze d th roug h L 16(45 o rthog ona lly d e s i g ne d e xp e ri m e n t . A nne a li ng tem p e ra tu re a nd num b e r of am p lific a ti on c yc l e s w e re op ti m ize d th roug h s i ng le fa c to r e xp e ri m e n t . The re s u lts s how e d tha t h ig h q ua lity g e nom ic DNA c ou ld b e ob 2ta i ne d fo r PCR a na l ys e s b y the m od i fie d C T AB m e thod. The op ti m a l re a c t