微生物计数讲课稿.ppt

微生物的计数技术;一、测定微生物数量的方法;显微镜直接计数法;直接计数法（总菌数测定法）;血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。;计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。;血球计数板;;16小格 × 25中格计数室 ; 每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。 使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。;已知：1毫升=1cm3=1000mm3 １cm3体积应含有小方格数为1000mm3／（ l／4000mm3） 　　　＝４X106;计数;;l.菌悬液制备 以无菌生理盐水制成浓度适当的菌悬液。每小格内约有3~5个菌体为宜。 2.镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。 3.加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。;4.显微镜计数加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。位于中格双线上的菌体一般只数上方和左边线上的。如遇芽胞大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。 5.清???血细胞计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 ; 1.有压线的菌体，计上不计下，计左不计右。出芽计一半。 2.因菌液在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下才能看全，所以，观察时必须不断调细螺旋（调焦距长短），方可找全 3.每个样品重复2—3次，若两次差别太大应重测;死、活细菌的区分;间接计数法;特点;平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测;用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。;通常测定细菌菌剂含菌数时，10-7、10-8、10-9 土壤细菌数量，采用10-4、10-5、10-6 放线菌数量，采用l0-3、10-4、10-5 真菌数量，采用10-2、10-3、10-4 ;混合平板培养法涂抹平板培养法。; ?将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基，轻轻转动平板(P112)，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。;（2）涂抹平板计数法?;基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。 ;结果计算;每ml(g)样品中的活菌数= （每皿菌落数平均值/取样体积）×稀释倍数;将实验结果填入下表中 ? ;菌落计数规则：;（二）所有菌落数均不在30~300间 以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数 1、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告； 2、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；