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植物总DNA的提取
化学生物学实验
中南民族大学 药学院
化学生物学教研室
1.实验目的
1 学习和掌握学习CTAB法提取植
物总DNA 的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定
2
DNA 的纯度和浓度。
植物叶片经液氮研磨,可使细胞壁破 2.实验原理
裂,加入去污剂 (如CTAB),可使核蛋白
体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA
进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。本实
验采用CTAB法,其主要作用是破膜。CTAB
是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂
肪,也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的
处理下, 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋
白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸
形成复合物,此复合物在高盐 (0.7mM)
浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度
(0.1-0.5mM NaC l)下CTAB-核酸复合物就
因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质
及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异 由于核酸、蛋白质、多糖
戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色 在特定的紫外波长都有特征吸
素等来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉 收。核酸及其衍生物的紫外吸
淀剂将DNA沉淀分离出来。 收高峰在260nm。纯的DNA样品
A260/280≈1.8,纯的RNA样品
A260/280≈2.0,并且1 μg/m l
DNA溶液A260 0.020。
3.实验器材与试剂
1、高压灭菌锅
2、冰箱
3、恒温水浴锅
4、高速冷冻离心机
5、紫外分光光度计
6、剪刀
7、陶瓷研钵和杵子
8、磨口锥形瓶 (50ml)
9、滴管
10、细玻棒
11、小烧杯 (50ml)
12、离心管 (50ml)
13、植物材料
3.实验器材与试剂
1、3 ×CTAB buffer (pH8.0)
100mM Tris
25mM EDTA
1.5M NaCl
3% CTAB
2% β-巯基乙醇
2、TE缓冲液 (pH8.0)
10mmol/L Tris•HCl
1mmol/L EDTA
3、氯仿-异戊醇混合液 (24:1,V/V )
4、95%乙醇
5、液氮
4.实验步骤
1、称取0.1g新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。
2、将叶片剪成l cm长,置于预冷的研钵中,倒入液氮,尽快将叶片研磨成
粉末。
3、将液氮挥发完后,加入0.5 ml预热 (60℃ )的CTAB提取缓冲液,转入
一离心管中,置于65℃水浴保温0.5 h,不时地轻轻摇动混匀。
4、取出稍冷后,加等体积的氯仿:异戊醇混合液,轻轻颠倒混匀,室温下
7000 rpm离心10 min。
5、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中,加2倍体积
的乙醇 (95%乙醇),轻轻混匀,使核酸沉淀下来,室温下10000 rpm
离心10 min。
6、倒掉上清夜,向离心管中加1 ml洗涤缓冲液,轻轻转动离心管,使核酸
沉淀悬浮起来,洗涤2 min,在室温下5000 rpm离心5 min。
7、重复洗涤一次,并于室温下使DNA沉淀干燥,变为透明状。
8、将DNA沉淀溶于100μl TE溶液中,于-20℃
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