铁皮石斛的组织培养.docx

由于石斛自然繁殖力极弱，生长缓慢，加之人们掠夺性采挖， 资源已严重枯竭。而石斛栽培 一直未解决其存活率低、进入盛产期年限长等问题，故石斛药源一直处于紧张状态。因此， 组织培养、遗传转化、菌根技术、悬浮培养等生物技术在石斛的应用意义重大，甚为迫切。 石斛的组织培养，可用种子、根、茎尖、茎节及叶等为外植体，但以种子进行组培快繁的为 多。原球茎的增殖分化是石斛试管苗繁殖的关键， 因此，研究原球茎增殖分化的适宜培养条 件非常重要。特别是应用组织培养技术快速大量繁殖石斛试管苗， 是解决其种苗与发展生产 的有效途径。 铁皮石斛的组织培养 铁皮石斛，又名铁皮兰、节草、耳环石斛等。野生铁皮石斛为国家珍稀濒危保护植物 （三级）。 由于其生长环境要求特殊，野生资源已濒临灭绝。现云南晨安生物科技开发有限公司对铁皮 石斛的组培快繁已获成功，月出苗量 50万瓶以上，为铁皮石斛工厂化育苗和大面积栽培闯 出了一条新路。 1胚培养（种子培养）：取人工授粉的铁皮石斛果实，用 75 %的乙醇表面消毒，30s后再 用0.1 %升汞溶液消毒 8min ,无菌水冲洗4~5次。在无菌操作下，把果实切成 0.1mm 见 方的小块，接种到培养基上，每瓶 3~5块。研究结果表明，N6培养基对种子萌发和生长 最好，蔗糖浓度2 %最佳，NAA浓度0.2~0.5mg/L 最适合胚的萌发和生长； 种子培养中加 入椰乳对胚萌发和萌发后的初期生长起促进作用； 而香蕉汁对继代培养中石斛的生根和壮苗 起促进作用，生根和壮苗培养中不加入 NAA ,只用N6+10 %香蕉汁，苗长得更粗壮。培养 温度25~28 C,光照强度1600~2000lx ，每日10~12h。种子萌发后，转管 3~4次，当 幼苗长出4~5片真叶并具有3~4条1~2cm长的根时，可将试管苗进行炼苗后移栽。 45在实验中尚发现，石斛原球茎的增殖与胚龄相关，不同胚龄培养，其萌发率不同：胚龄 45 天以下，萌发率极低，萌发时间长； 60天胚龄的胚具34个细胞，萌发率为 6%; 90天胚 龄的胚细胞为74个，萌发率为87 %; 120天胚龄的细胞数为 90个，萌发率95 %以上。 实验表明，组织培养的最适胚龄以种子成熟时较好，随着胚龄增长，其胚细胞愈多，萌发率 越高。原球茎增殖分化的最适培养基为改良 N6+NAA0.2mg/L+2 %蔗糖。种子萌发成苗后 需及时将小苗转移到合适的培养基中进行生根、 壮苗培养。有报道，铁皮石斛试管茁壮苗阶 段的适宜培养基为 B6 （或1/2MS ） +10 %香蕉水提物+NAA2.0mg/L+2 %蔗糖。生根壮苗 培养基为改良N6+10 %香蕉+2 %蔗糖，苗长得更粗壮。将萌芽石斛继代培养于 N6+10 % 香蕉汁生根壮苗培养基中，苗长得更粗壮。 2茎尖培养：取铁皮石斛当年萌发的嫩茎尖，用 10 %次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗 4~5次后接种到培养基上。研究结果表明，培养温度为 25~28 C,光照度1600~2000lx , 每日光照10~12h。在MS+NAA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基中培养 30天左右，外植 体则可诱导出大小不一的白色颗粒状愈伤组织，再过 20天形成不定芽。将愈伤组织和不定 芽切割开，再接种到 MS+NAA0.2mg / L+6-BA0.5mg/L 中，愈伤组织会增殖并产生不定 芽，再将不定芽移到 N6+10 %香蕉汁中培养30天左右，则会生根长成植株。 3幼嫩茎段培养：剪取铁皮石斛幼嫩茎段，按常规表面灭菌，切成 2.0cm左右的切段，每 一切段应至少保留1个节，将其接入芽增殖培养基 MS+NAA0.1~0.5mg/L+6-BA0.5~2.0mg/L 。（蔗糖浓度 3.0 %, PH5.4~5.8，下各培养 基均同）中培养。培养条件：培养温度（ 25 ±2）C,连续光照培养，光照强度 1500lx。培 养30~50天后，可在节间处长出1~2个新芽。将新芽切下，再接入芽增殖培养基中继代培 养，经过30天培养，在切口处长出 4~6个芽，形成丛生芽簇。将丛生芽切割后，在芽增 殖培养基中继续增殖培养，则可获得大量丛生芽。将上述丛生芽切割成单苗，转入壮苗培养 基MS （无激素）中培养，40天后，芽可发育成高3.0cm以上并具2~3片叶的健壮无根苗。 再将经过壮苗培养的无根苗，转接到生根培养基 1/2MS+IBA0.1mg/L 中培养40~60天， 在苗基部便可长出多条肉质、绿色气生根，形成完整植株。 尚有报道，取铁皮石斛茎，去叶、洗净、表面灭菌后，在无菌条件下切成约 5mm长的小段， 每段必具一个茎节，接种于 1/2MS或努森培养基内，置（26 ±1 ）。光照条件下培养，约 2 周，腋芽长出，约1个月则可形成完整植株。 4炼苗与移栽：当试管苗有 4~5片叶展开，