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低温是限制植物生长，发育和分布的重要环境因素之一， 低温不但降低植物的生命合成活性，抑制正常的生理代谢过程，而且严重时还会导致植物死亡。 低温寒害是农业、林业生产的主要自然灾害之一。 甜杨(Populus suaveolens)：属杨柳科(Salicacae)，主要分布于大兴安岭北部及漠河一带，是研究木本植物抗冻性及有关抗冻基因克隆的理想材料。 G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)：磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶，其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH，也为核酸合成提供戊糖；此外，还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此，G6PDH 对植物的生长发育起着非常重要的作用。 Published by Biotechnology letters: 21，May,2013 Factor：1.853 报告人： 专业：生物学基地 年级：2011级 日期：2014年5月11号 背景介绍 2. 实验方法 3. 结果与讨论 主要内容 4. 实验结论 5. 前景展望 背景介绍 低温的危害： 常规育种存在的不足： 育种周期长，杂交方式单一，杂交难度大等局限性，杂交工序复杂费时，易受季节、气候、地域及水分等多种环境因素限制。 背景介绍 背景介绍 甜杨中分离G6PDH基因 生物学分析 PsG6PDH的原核表达 该基因可能编码胞质PsG6PDH而且与基因胁迫有关 验证了其编码框的完整性 导入烟草进行表达和分析 对其功能进行进一步鉴定 实验部分 实验部分 甜杨 高效稳定的离体培养体系的建立 总RNA的提取 基因组DNA的制备 G6PDH基因的分离和克隆 植物表达载体的构建和遗传转化 转PsG6PDH基因烟草材料的获得 低温抗性实验 电导率的测定 超氧化物歧化酶SOD活性的测定 过氧化物岐化酶POD活性的测定 丙二醛MDA含量的测定 PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用 The predicted tertiary structure of PsG6PDH protein 结果与讨论 含有NADP结合区（红色）和G6P结合区（蓝色）两个保守功能域，具有多个磷酸化位点和跨膜区域，表明PsG6PDH可能作为膜受体而起作用 系统发生树 结果与讨论 实验部分 甜杨 高效稳定的离体培养体系的建立 总RNA的提取 基因组DNA的制备 G6PDH基因的分离和克隆 植物表达载体的构建和遗传转化 转PsG6PDH基因烟草材料的获得 低温抗性实验 电导率的测定 超氧化物歧化酶SOD活性的测定 过氧化物岐化酶POD活性的测定 丙二醛MDA含量的测定 PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用 实验部分 植物表达载体的构建： PsG6PDH 烟草的遗传转化： 实验部分 利用经典的的叶盘转化法把甜杨G6PDH基因转入烟草，经过含Kan和Cef培养基的筛选、继代和生根培养，得到一批转基因烟草。 30 days old，将植株转入土壤，在植物培养箱中under 15%，a 16/8h light/dark photoperiod for 1 month。 Used for cold tolerance assays and gene expression analyses 实验部分 甜杨 高效稳定的离体培养体系的建立 总RNA的提取 基因组DNA的制备 G6PDH基因的分离和克隆 植物表达载体的构建和遗传转化 转PsG6PDH基因烟草材料的获得 低温抗性实验 电导率的测定 超氧化物歧化酶SOD活性的测定 过氧化物岐化酶POD活性的测定 丙二醛MDA含量的测定 PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用 低温抗性试验： 实验部分 （1）未经15℃低温驯化：培养温度直接从25 ℃下降到4 ℃，每隔12h观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.a) （2）经15 ℃低温驯化：培养温度先降至15 ℃后缓慢下降到-4 ℃，按0.5 ℃/h逐步降低温度，在每处理温度下24h，观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.b) 取生长性状一致的野生型和转基因烟草 (a). Without cold-acclimation 结果与讨论 低温抗性试验： 实验部分 （1）未经15℃低温驯化：培养温度直接从25 ℃下降到4 ℃，每隔12h观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.a) （2）经15 ℃低温驯化：培养温度先降至15 ℃后缓慢下降到-4 ℃，按0.5 ℃/h