细胞培养技术入门.pptxVIP

◆ 在细胞培养中注意的一些问题◆ 细胞培养的实验程序◆ 细胞的复苏 ◆ 细胞的计数 ◆ 细胞(贴壁)的传代培养? ◆ 细胞的冻存◆ 悬浮细胞的培养方法 在细胞培养中注意的一些问题 环 境 由于体外培养细胞没有抗感染能力，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠，特别是实验环境更为重要。 1.培养室和超净台的消毒 ★ 培养室 无菌培养室每天都要用速消净或0.2％的新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30～50min。★ 超净工作台 台面每次实验前要用 75％酒精擦洗，然后紫外线消毒30 min。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75％酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。2. 培养前准备 在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。3. 培养条件 ★ 气体环境：95％空气加5％CO2混和气体环境中。 ★ PH值：7.2～7.4 ★ 温度：37℃ 培养实验用品的前期处理1.清洗和浸泡:(1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。 （2)塑料器皿:塑料器皿经冲净后，晾干，用2％NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5％盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。针头式滤器不能泡酸液,用2％NaOH泡6～12小时,或者煮沸20分钟,常规冲洗干净，烘干（60℃以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装时注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微 拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水处理30钟），自来水洗净，烘干然后再泡入1％稀盐酸液中30分钟，用自来水彻底冲洗3-5遍，蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸漂洗2遍，烘干备用。2.包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。 3.消毒: 在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。（1）消毒灭菌的方法 : ★ 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物. ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 (2)消毒灭菌的时间： ★ 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160℃，保持90～120 min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。 ★ 湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒，要求是： ◆ 不能装太满，保持消毒器内气体流通。 ◆ 在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出。 关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。 ◆ 一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是 15磅20 min；常规使用液体：消毒 15磅 15 min 。橡胶和塑料用品 ：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min。★ 紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为30min－2h左右。★ 过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。 4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ，可高压除菌。（3）消化液 ： ★ 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25 ％，pH值7.2左右。需过滤除菌。★ EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。★ 胰蛋白酶EDTA－Na2:需过滤除菌。胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被