RT-PCR详细图文解析.doc

一、实时荧光定量 PCR原理 （一） 定义：在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 （二） 实时原理 1、 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩 增反应实时检测。 2、 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测 PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化， 通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量? 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 4、几个概念: （1 ）扩增曲线 扩壇曲线图: 檢坐诵t扩增循环数 Cv de :纵坐椒烫光整 每个循环进行一次荧光信号的收集 CT值的重现性: c值的特点. ■相同模板进行9澈扩增，终点处产物量不恒定孑 -G值则极具重现性 5、定量原理： 理想的PCR反应： X=Xo*2 非理想的PCR反应： X=Xo (1+Ex) n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 Xo :初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 □模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少.即Ct值越小 □ Log浓度与循环数呈线性关系.通过已矩起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，根据样品CHT就可以计算出样品中所含的模 板量 6、绝对定量 1 )确定未知样品的 C(t )值 2)通过标准曲线由未知样品的 C(t)值推算出其初始量 7、DNA的荧光标记: 非特异性荧光标记： Is SYBR Green 特异性荧光标记： 2、JLqqM©!! 电9  2、SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光 3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链 DNA, SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号 SG SG SG SG Emission iiTi ^iir fi i ii 11 r iT iin i n 11 i 11 n r 11 彳 T ii hiiiiii mi cf SG SG SG~ Tm值：DNA解链一半时的温度 •将温度与荧光强度的变化求导。（・dI/dT）   □ Log浓度与循环数呈线性关 系，根据样品Ct值，就可以计算 岀样品中所含的模板量 PCR反应体系的建立及优化 1、 SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、 Primer :引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、 MgCI2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、 反应Buffer体系的优化 5、 反应温度和时间参数：由酶和引物决定 6、 其他与常规 PCR相同 (二) 应用范围 1、起始模板的测定； 2、 基因型的分析； 3、 融解曲线分析：可以优化 PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对 primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 (三) 优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何 DNA ；使用方便；不必设计复杂探针； 非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析， 优 化反应条件； 对引物特异性要求较高。 方法二：TaqMa n--- 水解型杂交探针 与目标序列互补 **5端标记有报告基团(Reporter, R)，女口 FAM、VIC等 **3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) **探针完整，R所发射的荧光能量被 Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 **Taq酶有5宀3外切核酸酶活性，可水解探针 （一）工作原理 注意：每扩增一条 DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 PCR反应的建立： 1、 引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 C , 30 bp, 5不能有G, G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段 400 bp，引物Tm为59-60 C 2、 反应参数的确定： 一般为：94 C, 10-20S 60 C, 30-60S （Taq酶5 — 3外切核酸酶活性在 60 C 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 C, 45 S , 3、 优化引物和探针浓度：获得最小 Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、 其他与常规 PCR相同 （二）优缺点 优点： 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 缺点： 只适合一个特定的目标； 委托公司标记，价格较高； 不易找到本底低的探针