《细胞工程基本原理与技术应用》竞赛全套干细胞工程.ppt

《细胞工程基本原理与技术应用》竞赛全套干细胞工程;;一、什么是干细胞？;1.形态特征和生化特征 形态特征—圆形或椭圆形，核质比大； 生化特征—较高的端粒酶活性。 2.增殖特征 增殖的缓慢性 增殖的自稳性（区别与肿瘤细胞的本质特征）;全能干细胞 多能干细胞 单能干细胞;全能干细胞： （Totipotent stem cell）;胚胎干细胞;成体干细胞;胚胎干细胞;胚胎干细胞的分类;衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； 永生化(immortal)； 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 有稳定的发育潜能，能被诱导???殖或分化； 能参与胎儿所有组织的发育过程；;形态特征 体积小、核大，有一个或多个核仁； 胚胎干细胞克隆紧密堆积，无明显的界限，形似鸟巢 生化特征 具有碱性磷酸酶和端粒酶活性； 表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等； 表达OCT-4蛋白； 无X染色体失活。;胚胎干细胞的分离;人类干细胞的来源;胚胎干细胞系的建立过程;胚胎干细胞的培养 ;干细胞培养过程;培养条件： 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。;干细胞的分化;干细胞诱导分化的常用方法 （1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等 （2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细 胞内 ;胚胎干细胞的诱导分化： 　　胎牛血清，骨髓基质细胞共培养 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?造血细胞 　　　RA 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?神经细胞 　　　　　　DMSO 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?肌肉细胞 　　　　TGF-B1, VEGF, bFGF 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?血管和内皮细胞 　　　　　RA+胰岛素+T3 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?脂肪细胞 　　　　　BMP-2, BMP-4 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?软骨细胞 　　　　地塞米松，磷酸甘油 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?骨细胞 　　　　　基因转染 胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－?胰岛素分泌细胞;胚胎干细胞的鉴别 　 胚胎干细胞具有以下特点： (1) 细胞内碱性磷酸酶活性高 (2) 端粒酶活性高 (3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色 (4) 细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, 　 TRA-1-60, TRA-1-81 (5) 能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植 　 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6) 可诱导分化为各种成体干细胞;胚胎干细胞的特性;鉴定干细胞的常用方法： （1）细胞形态与结构 （2）细胞功能 （3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达; 内皮细胞 : （1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛 　　　胞内连接；大量吞饮泡 （2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或 　　　CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3 ；CD34 ； 　　　JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32 　　　以及MEC-14，7抗原 （3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2 ;心肌干细胞： （1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛 　　的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片 　　钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH 　　和If （3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链 ; 神经干细胞: （1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突 （2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体 （3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1