可用基因工程及其应用.ppt

DNA连接酶与DNA聚合酶有什么区别呢？（2）作用部位：磷酸二酯键，不是氢键GCTTAAAATTCG磷酸二酯键磷酸二酯键（1）作用对象：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子２、基因的针线──DNA连接酶第21页,共44页，2024年2月25日，星期天DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？相同点：两者都是形成磷酸二酯键。不同点：DNA连接酶:是将DNA片段上的两个粘性末端连接起来，不需要模板。DNA聚合酶:在DNA复制中，以DNA一条链为模板，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接起来，形成一条与模板链互补的DNA链；第22页,共44页，2024年2月25日，星期天3、基因的运输工具——运载体②具备条件：③种类：能自我复制、稳定保存。

具有多个限制酶切点。

具有某些标记基因。质粒、噬菌体和动植物病毒。①作用：将外源基因送入受体细胞。第23页,共44页，2024年2月25日，星期天什么是质粒？细胞拟核外或染色体外能自主复制的双链环状DNA分子存在于细菌以及酵母菌等生物中细菌的质粒比细菌的拟核DNA小得多带有少量基因常有抗生素抗性基因,使细菌有抗药性质粒与宿主细胞的关系质粒的存在对宿主细胞无影响，质粒的复制只能在宿主细胞内完成质粒（最常用的运载体）第24页,共44页，2024年2月25日，星期天常用的运载体——质粒（标记基因）（环状DNA分子）第25页,共44页，2024年2月25日，星期天pBR322多个酶切位点抗四环素基因（tcr）抗安苄青霉素基因（amp）第26页,共44页，2024年2月25日，星期天第27页,共44页，2024年2月25日，星期天二基因操作的基本步骤１、提取目的基因——将

需要的基因从供体生物

的细胞内提取出来。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶广泛使用目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、干扰素基因、植物抗病基因、种子贮藏蛋白基因等。第28页,共44页，2024年2月25日，星期天用限制酶切断成许多片段⑴直接分离基因法鸟枪法（散弹射击法）把带有目的基因的DNA片段分离出来供体细胞中的DNA限制酶切成许多片段运载体重组DNA受体细胞基因扩增（大量复制）分离含有目的基因的细胞最大的优点：操作简单最大的缺点：盲目性大，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。第29页,共44页，2024年2月25日，星期天⑵人工合成基因(真核细胞)DNA合成仪有两种方法：

①反转录法：

②直接合成法：目的基因的mRNA单链DNA逆转录双链DNA（目的基因）合成氨基酸序列推测mRNA核苷酸序列推测基因的核苷酸序列化学合成目的基因优点：针对性强，目的基因不含内含子第30页,共44页，2024年2月25日，星期天2、目的基因与运载体结合（1）实质：将不同来源的DNA重新组合的过程第31页,共44页，2024年2月25日，星期天（2）过程用同一种限制酶切割质粒和目的基因产生相同的黏性末端重组DNA分子（重组质粒）思考：目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？将目的基因插入质粒切口处DNA连接酶三种情况：目的基因与目的基因结合质粒与质粒结合目的基因与质粒结合第32页,共44页，2024年2月25日，星期天目的基因与运载体结合质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA第33页,共44页，2024年2月25日，星期天3、将目的基因导入受体细胞导入扩增（1）常用受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、土壤农杆菌、动植物细胞（2）导入方法：借鉴细菌或病毒侵染细胞途径如受体细胞：细菌细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制氯化钙（Cacl2）第34页,共44页，2024年2月25日，星期天4、目的基因的检测和表达无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物（1）受体细胞是细菌的检测：将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有标记基因的表达产物。检测：通过检测受体细胞是否表现出标记基因所控制的性状，来判断目的基因是否导入表达：通过受体细胞是否表现出目的基因所控制的特定性状，来确定目的基因是否表达第35页,共44页，2024年2月25日，星期天（2）受体细胞是多细胞生物的检测:将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，目的基因是否表达（是否表