第三章 重组DNA技术所需的基本条件课件.ppt

第三章重组DNA技术所需的基本条件;A用于核酸操作的工具酶;限制性核酸内切酶;ATPMg2+SAM;第三章-重组DNA技术所需的基本条件; 限制性核酸内切酶

II型限制性核酸内切酶的基本特性

识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列

大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧

识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构;第三章-重组DNA技术所需的基本条件;第三章-重组DNA技术所需的基本条件;第三章-重组DNA技术所需的基本条件; 限制性核酸内切酶

II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作

大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：;第三章-重组DNA技术所需的基本条件;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶; DNA连接酶

DNA连接酶的基本性质

; DNA连接酶

DNA连接酶的基本性质

; DNA连接酶

DNA连接酶的基本性质

; DNA连接酶

DNA连接酶的反应条件;DNA连接酶; DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）; DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）

大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：;DNA聚合酶;DNA聚合酶; DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端; DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记;DNA聚合酶; DNA聚合酶

T4-DNA聚合酶

T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端; DNA聚合酶

T4-DNA聚合酶

T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记

; DNA聚合酶

依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）

反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链; DNA聚合酶

依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）

反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链;核酸酶

单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）

2+; 核酸酶

双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）

大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切; 核酸酶

双链核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）

λ核酸外切酶特异性地从5‘端外切;Zn2+必需; 核酸酶

单链核酸内切酶：S1核酸酶

S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA

; 核酸酶

单链核酸内切酶：S1核酸酶

S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA

; 核酸酶

单链核酸内切酶：S1核酸酶

S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）

; 核酸修饰酶

末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）

TdT的基本特性：来自小牛胸腺

不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs;TdT的基本特性：; 核酸修饰酶

碱性磷酸单酯酶(DNA和RNA分子中除去5′-磷酸残基，即脱磷酸作用)

来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）

来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）; 核酸修饰酶

T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）

T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷。

用于探针的末端同位素标记：;B用于基因克隆的载体;载体的功能及特征;载体的功能及特征;质粒;质粒;质粒;质粒; 质粒

携带特殊的遗传标记

野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这

使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：; 质粒

质粒的构建

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点

少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往

往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构

建的：; 质粒

质粒的分类

人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：

高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因

低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因; 质粒

重要的大肠杆菌质粒载体

; 质粒

重要的大肠杆菌质粒载体

; 质粒

重要的大肠杆菌质粒载体

;质粒;质粒;; 质粒

质粒DNA的分离纯化

氯化铯密度梯度离心法：; 质粒

质粒DNA的分离纯化;质粒;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;λ噬菌体生