《基因的突变与进化》13基因工程与基因治疗.ppt

上次复习 人类起源 研究人类起源的遗传学工具 遗传学对人类起源的基本结论 目前地理上的人口格局：多区域起源 单区域起源 基因组学 基因组学的基因概念 基因组学的学科分类 基因祖学的发展 全基因组测序 目的 研究工作 生物产品(生物反应器) 改良物种(提高品质) 基因治疗 一，工具酶的发现和基因工程的诞生 A. 剪切酶类 有目的有选择的把目的片段切开 B. 连接酶类 将目的片段和载体相连 C. 其他工具酶 修饰, 加工等作用 同切酶和同粘酶 同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端 B,连接酶及其对底物的要求: T4 Ligase, Ecoli Ligase 具体细节 工作酶来源 工具酶价格 工具酶实验方法 酶切，回收，连接 展示 二，基因工程的基本过程 1，目的基因的获得 2，目的基因和载体相连，获得重组DNA分子 3，重组DNA分子导入受体细胞 4，筛选含重组DNA分子的受体细胞 5，检查目的基因的表达 1，目的基因 种类 来源 酶切而来 PCR扩增而来 PCR技术及其应用 应用范围： 检测和诊断（高灵敏度） 基因克隆（eg: 通过部分已知序列扩增未知目标片段 2，载体及其构成基本要素 能独立复制并稳定传代: 复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记 易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主 常用载体 质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC 常用受体细胞 大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因表达 4，连接，转化（导入） 提高插入片段和载体的比例 尽可能采用粘端连接* 载体脱磷以降低载体自连 改进转化条件：热激、、、、 三，基因工程的应用 转基因生物 转基因动植物和基因治疗 转基因动物：医学研究，生物制药 转基因植物：改良品质，提高抗逆能力 基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病 为什么在二个品系中结果不同？ 几个问题 稳定(stable)表达，瞬时(transition)表达 随机整合，同源重组 抗病毒，抗细菌 抗虫棉花 抗冻番茄 * 基因工程 利用转基因手段对生物进行人为改造的技术 体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术 Out of Africa A,限制性内切酶II及其产生的3种不同末端 5突出的粘性末端 3突出的粘性末端 平末端 EcoR I EcoR V Pst I P P P P P P 回文结构 Sma I 5′ ... C C C^G G G ... 3′ 3′ ... G G G^C C C ... 5′ Xma I 5′ ... C ^ C CG G G ... 3′ 3′ ... G G GC C ^ C ... 5′ 同切酶 BamH I 5′ ... G^G A T C C ... 3′ 3′ ... C C T A G^G ... 5′ Bgl II 5′ ... A^G A T C T ... 3′ 3′ ... T C T A G^A ... 5′ 同粘酶 Sau3A 5′ ... ^G A T C ... 3′ 3′ ... C T A G^ ... 5′ 底物: 自由5’末端和自由3’末端, 5’末端带磷酸基团 反应条件：Mg++，ATP存在 区别 聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端转移酶 外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I 脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP, 磷酸化酶,激酶(kinase) 逆转录酶(reverse transcriptase) RNase H, RNase A 甲基化酶(methylase) 其它工具酶 特殊用途的载体 表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体 lacZ 3，受体细胞 繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 对所携带基因的表达产物具有较