第二讲_cDNA芯片与基因表达分析课件.ppt

第一部分 cDNA芯片回顾 cDNA芯片的特点 原理： cDNA是与mRNA互补的DNA分子，长约0.2~5kb 通过碱基互补配对原则进行探针与待测mRNA之间的分子杂交产生信号，反映待检mRNA水平，在一定程度上体现基因的表达水平 寡核苷酸芯片的特点 原理： 通过碱基互补配对原则进行杂交，检测对应片段是否存在、存在量的多少 优点： 可以通过原位合成法制备； 探针长度小，减少二级结构形成 ； 减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因； 无需扩增，防止扩增失败影响实验； 杂交温度均一，提高杂交效率 缺点： 当寡核苷酸序列较短时，单一的序列不足以代表整个基因，需要用多段序列 cDNA芯片的优缺点 cDNA芯片的优点 序列长度长，可直接检测待检mRNA 结合敏感性强 信号强度大 cDNA芯片的缺点 探针退火温度差异大 存在非特异性交叉杂交 cDNA芯片应用领域 基因表达分析 等位基因探查 基因多态性分析 表达谱数据库 第二部分 cDNA表达芯片数据预处理 对数转换 数据过滤 数据过滤的目的是去除表达水平是负值或很小的数据、或者明显的噪声数据 过闪耀现象 物理因素导致的信号污染 杂交效能低 点样问题 其它 数据补缺 (一)数据缺失类型 非随机缺失 基因表达丰度过高或过低 随机缺失 与基因表达丰度无关，数据 补缺主要针对随机缺失情况 数据补缺方法 K近邻法 回归法 数据标准化 数据标准化的原因 存在不同来源的系统误差 染料物理特性差异(热和光敏感性，半衰期等) 染料连接效能 点样针差异 数据收集过程中扫描设施误差 不同芯片差异 实验条件差异 施加标准化处理的基因 芯片上大部分基因(假设芯片上大部分基因在不同条件下表达量相同) 不同条件间稳定表达的基因(如管家基因) 控制序列(spiked control ) 合成DNA序列或外源的DNA序列，在不同条件下表达水平相同。 cDNA芯片数据标准化处理 1、片内标化(Within-slide normalization) (1) 全局标化(Global normalization) (2) 荧光强度依赖的标化(Intensity dependent normalization) (3) 点样针依赖的标化(Within-print-tip-group normalization) (4) 尺度调整(Scale adjustment) 为什么 调整不同栅格(grids)间的数据离散度 方法：计算不同栅格的尺度因子 2、片间标化(Multiple-slide normalization) 线性标化法(Linear scaling methods) 与芯片内标化的尺度调整(Scale adjustment) 方法类似 非线性标化法(non-linear methods) 分位数标化法(Quantile normalization) 两张芯片的表达数据的分位数标化至相同，即分布于对角线上。 3、染色互换实验(dye-swap experiment ) 的标化 实验组 对照组 芯片1 cy5(R) cy3(G’) 芯片2 cy3(G) cy5(R’) 前提假设：c︽c’ 方法: 前面提及的标准化方法仅效正了数据分布的中心，在不同的栅格间log-Ratios 的方差也不同。 第三部分 cDNA表达芯片数据分析 差异表达分析 一、倍数法 二、t检验法 三、方差分析 方差分析可用于基因在两种或多种条件间的表达量的比较 它将基因在样本之间的总变异分解为组间变异和组内变异两部分。 通过方差分析的假设检验判断组间变异是否存在，如果存在则表明基因在不同条件下的表达有差异。 四、SAM （Significance Analysis of Microarrays) (一) 多重假设检验问题 Ⅰ型错误（假阳性）即在假设检验作推断结论时，拒绝了实际上正确的检验假设，即将无差异表达的基因判断为差异表达。 Ⅱ型错误（假阴性）即不拒绝实际上不正确的，即将有差异表达的基因判断为无差异表达。 在进行差异基因挑选时，整个差异基因筛选过程需要做成千上万次假设检验，导致假阳性率的累积增大。对于这种多重假设检验带来的放大的假阳性率，需要进行纠正。常用的纠正策略有Bonferroni效正，控制FDR（False Discovery Rate）值等。 (二) 分析步骤 计算统计量 扰动实验条件，计算扰动后的基因表达的相对差