hrp标记cea单抗2建立elisa夹心法测定人体血清中cea含量;免疫磁珠在elisa中的应用及方案设计.ppt

1.3 免疫磁珠技术 免疫磁珠（IMB）技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原-抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。 基本原理：磁性微球经过一定处理后，可将抗体结合到磁珠上，形成免疫磁性微球，免疫磁性微球的抗体与特异性抗原结合形成抗原-微球复合物，该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性，在磁力作用下，该复合物发生力学移动，从而达到分离抗原的目的。 2.免疫磁珠技术的应用及优缺点 2.1 应用 食品有害微生物的检测（大肠杆菌0157、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等） 与PCR、ELISA及发光检测手段（荧光免疫分析、电化学发光分析等）的联用 细胞分离、生物大分子纯化等 2.2 优缺点 优点： 分离速度快、效率高 可重复性好、操作简单 不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能 缺点; 进口免疫磁珠价格昂贵，而国产磁珠敏感性不佳 特异性与所用抗体密切相关，有可能不能避免与其它物质交叉反应，因此需要辅助其它方法同时检测 3.免疫磁珠与ELISA联用的方案设计 磁珠-亲和素→生物素-抗体A →抗原→抗体B → HRP标记的二抗(C)→过氧化脲→鲁米诺显色 磁珠 A B C A A B B C C 具体操作： 亲和素标记的磁珠与生物素标记的抗体A结合 置于磁场中，依次添加抗原、抗体B、二抗（HRP标记）每一步均可用移液枪直接吸走管内液体 最终加入过氧化脲及鲁米诺显色 方案涉及技术： 生物素标记抗体（有资料） 亲和素标的磁珠与生物素标记的抗体结合（根据磁珠型号种类不同，由磁珠公司提供） 双抗夹心ELISA（技术成熟） 鲁米诺化学发光（有资料） 实验所需购买材料、试剂 材料、试剂 订购公司 价格 预计使用量 过氧化脲 金泰公司（长春） 100g HRP标记羊抗鼠 金泰公司（长春） 50ul X抗原 500ul X配对单抗A 2ml X配对单抗B 500ul 链霉亲和素标记磁珠 涛宇国际（上海） 2930RMB/10ml 20ml NHS-生物素 金泰公司（长春） 220RMB/5mg 10mg HRP标记单抗建立Elisa夹心法测定相应抗原含量 汇报人：闫斯楠 时间：13.7.6 一、CEA介绍 大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA），可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。 二、方案设计 常规夹心法 CEA抗体1-抗原-CEA抗体2-二抗（HRP标记） 本实验夹心法 CEA抗体1-抗原-CEA抗体2（HRP标记） 该方案是直接法与夹心法的有效结合，兼具两者的优点。为目前市面上Elisa检测试剂盒的通用发法。 三、主要技术方法 双抗夹心法Elisa HRP标记CEA单抗2 Sephadex?G-25层析法 1. Elisa A.实验步骤： 1.抗原预包被。用包被缓冲液将抗原稀释（浓度由预实验确定），每孔加入200微升，37℃孵育1小时后，4℃放置16-18小时。 2.洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤缓冲液，静止3分钟后倒掉。反复3次，最后一次尽量拍干板孔中剩余液体。 3.加封闭缓冲液每孔200微升，37℃放置1小时。 4.同2步洗涤。 5.加被测血清100微升（做梯度稀释），并作阳性、阴性及空白对照。37℃放置1小时或者4℃过夜。 6.同2步洗涤。 7.加二抗。50微升每孔加入适宜浓度的二抗，37摄氏度放置1小时。 8.同2步一样洗涤，并多重复一次，最后一次重复后一定要排干所有水分，否则会有假阳性出现。 9.显色。每孔加入底物溶液100微升，室温暗处放置10-15分钟，然后用终止液终止显色。 10.酶标仪读数。 B.需要配制的试剂 1.包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸缓冲液，4℃保存 Na2CO3 0.15g NaHCO3 0.293g 稀释至100ml 2.洗涤缓冲液：0.01M pH7.4 PBS-Tween-20，室温保存 NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4·12H2O 2.9g 或者Na2HPO4 1.15g