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* 最新.课件 * 最新.课件 * 最新.课件 * 最新.课件 * 最新.课件 * 最新.课件 蛋白原核表达 卫文强 2015.12 最新.课件 * 目的基因-T 表达载体 酶切, 胶回收,连接 转化到克隆用细胞(Top10) 提质粒,酶切验证 转化到表达用细胞(BL21(DE3)) 诱导表达 SDS最新.课件 * DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 1). DNA的纯度 ?影响限制性内切酶活性的因素 2). DNA的甲基化程度 dam甲基化酶(修饰GATC中的A); dcm甲基化酶(修饰CCA/TGG的C)。 最新.课件 * 3). 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC,少数要求40-65 oC。 是影响限制酶活性的重要因素。 4). 缓冲液(Buffer) 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 MgCl2、NaCl/KCl: 提供Mg2+和离子强度; Tris-HCl: 维持pH; 二硫苏糖醇(DTT):保持酶稳定性; 牛血清白蛋白BSA等:有助于酶的稳定; β-巯基乙醇:保持酶的稳定性,防止酶失活。 最新.课件 * 用时在冰上操作; 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%; 多种酶进行酶切时,先低盐后高盐缓冲液; 关心小贴士告诉你 ? 使用时注意事项: 最新.课件 * 连接、转化与重组子鉴定 1、连接 最新.课件 * (1)必须是两条双链DNA。 (2)DNA 3’ 端有游离的-OH, 5’端有一个磷酸基团(P)。 (3)需要能量 动物或噬菌体中:ATP 大肠杆菌中: NAD+ (2). 连接条件 最新.课件 * ? ATP:反复冻熔,ATP活性降低,ATP溶解度不高,连接缓冲液宜分装; ?单价离子:150-200mM NaCl,提高连接效果; ? PEG:5%以下可以提高连接效率 ?连接效果最好在37 ℃,但形成的互补不稳定; ?最佳连接温度:12-16 ℃,较好的连接效果,互补又较稳定; 2)连接温度: 3)反应液中的成分: 最新.课件 * ?目的或作用: 4)插入片段与载体的浓度比例 ?载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右,甚至1﹕10 或更高。 增加插入片段与载体的接触机会,减少载体自我连接的现象。 最新.课件 * 化学法(CaCl2法): 转化原理:是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内(感受态细胞)。 2、转化 最新.课件 * 影响转化率的主要影响因素: ? 载体本身的性质及其空间构象:超螺旋构象转化率最高; ? 插入片段的大小:插入片段越大,转化效率越低; ? 受体细胞的类型及预处理; ? 转化方法:电击法高于化学法。 最新.课件 * ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 4363 bp ori ? 限制性酶切图谱法 3、转化子的筛选和鉴定 最新.课件 * 质粒DNA的提取 基因组DNA 质粒DNA ?质粒具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 ?质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 最新.课件 * ⅰ质粒DNA提取方法: 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等 ⅱ 碱裂解法原理: 在碱性条件下,双连DNA氢键断裂,结构破坏变性,环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型,而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。 最新.课件 * ⅲ 抽提出质粒的构型: 1)超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中,超螺旋DNA占大部分
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