免疫组化PV二步法与SP三步法比较.doc

免疫组化PV二步法与SP三步法比较 目录 TOC \o "1-9" \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：免疫组化PV二步法与SP三步法比较 1 1 材料和方法 2 2 结果 4 3 讨论 4 文2：小学语文阅读教学三步法 6 一、发挥学生自主性，激发学生阅读兴趣 6 二、提倡合作探究活动，引导学生积极参与 7 三、开展形式多样的活动，丰富学生的体验 7 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 9 文章致谢（模板） 10 正文 免疫组化PV二步法与SP三步法比较 文1：免疫组化PV二步法与SP三步法比较 免疫组织化学技术是利用已知的特异性抗体与抗原的特异性结合来检测组织或细胞内某种物质的性质，并利用酶作用于底物所产生的颜色反应来显示某种物质的分布于细胞内定位的一种技术，自建立免疫酶标技术以来，这门技术得到了迅速 发展 ，在科研和临床诊断已被广泛应用。研究发现部分胃癌为雌激素受体依赖性［1］。但一张好的免疫组化切片需要真阳性染色结果表达在预期对应的组织细胞中，定位清晰准确，间质清楚,无或少背景着色［2］。影响免疫组化的结果有很多，如组织固定、脱水的过程、修复的好坏以及免疫组化的过程和免疫组化试剂盒的选取以及显色步骤均对结果有影响［3］。目前研究影响免疫组化结果的因素多从免疫组化试剂盒以外几方面分析，对不同原理的试剂盒对实验结果的影响研究甚少。本研究拟以ERα-36为目的指标，观察免疫组化两步法和三步法在ERα-36检测中的异同，探讨两种方法在使用中的优缺点。 1 材料和方法 材料 由江汉大学肿瘤教研室构建352点胃癌组织芯片，以正常肝组织作为定位标记，芯片直径㎜，片厚4ｕm。 ERα-36兔抗人多克隆抗体，由Creighton大学王兆一教授提供，以胞浆着色为阳性。三步法SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，二步法PV-9000试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。 方法 选用已知阳性的正常乳腺组织为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，染色步骤严格按说明书进行。苏木素复染核。 以三步法为例，具体操作如下： ① 石蜡切片常规脱蜡至水化，用PBS（pH ）冲洗3次，每次3min； ② 用EDTA缓冲液浸泡(pH ),高压修复2min，使抗原暴露； ③ 每张切片加150μl过氧化酶阻断溶液（试剂A），室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3min； ④ 除去PBS液，每张切片加150μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10min； ⑤ 除去血清，每张切片加150μl的第一抗体，4℃过夜； ⑥ PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS液，每张切片加150μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10min， PBS冲洗3次，每次3min； ⑦ 除去PBS液，每张切片加150μl链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3min； ⑧ 除去PBS液，每张切片加600μl的新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～10min； ⑨自来水冲洗，苏木素复染 ，自来水冲洗返蓝或冲洗后用PBS快速返蓝； ⑩ 梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。 两步法④至⑦步骤与三步法不同，不用正常血清封闭，直接滴加一抗过夜，然后直接滴加聚合了辣根过氧化物酶的特异性二抗，余步骤相同。 统计学处理 采用卡方检验，所有统计学采用完成，P＜为差异有显著意义。 2 结果 采用免疫组化三步法对胃癌组织芯片ERα-36进行处理后的染色结果均为浆着色，无核表达。染色结果为癌组织显示棕黄色的颗粒，背景清晰。根据芯片上显色结果的深浅我们对其进行了4个等级的评定：癌细胞胞浆无着色-;癌细胞胞浆上出现淡黄色染色颗粒+;癌细胞的胞浆上出现深棕黄色的染色颗粒为+++；介于+与+++之间染色深度为++。ERα-36的阳性率为(52/111)%，其各个等级表达率见表1。 采用免疫组化二步法对胃癌组织芯片ERα-36分别进行处理后，阅片标准同三步法。结果均为浆着色，无核表达。ERα-36的阳性率为(105/111)%，其各个等级表达率见表1。表1 二步法与三步法阳性率的比较由表1可见，二步法与三步法各个等级免疫组化ERα-36的阳性率存在显著差异，两步法高于三步法。 此外，我们通过使用二步法和三步法对ERα-36进行染色发现，三步法检测结果的背景较二步法低，非特异性着色小，检查出的阳性率低于二步法，且费用相对较少；但二步法步骤少，耗时较少，且无内源性生物素的干扰，检出的阳性率高，染色强度高，见表2。表2 二步法与三步法比较 3 讨论 关于胃癌的ER阳性率国外报道为23%（30/130）(免疫组化法)［4］,