(完整版)实验9水中总大肠菌群的测定—多管发酵法.docx

实验九 水中总大肠菌群的测定—多管发酵法 一．实验目的和要求 1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。 2．预习第六章细菌学检验法的关内容。 二．原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。 试验结果以最可能数 most probable number），简称 MPN 表示。三．仪器 (1)高压蒸气灭菌器。 (2)恒温培养箱、冰箱。 (3)生物显微镜、载玻片。 (4)酒精灯、镍铬丝接种棒。 (5)培养皿（直径 100mm）、试管（ 5×150mm），吸管（ 1、5、10mL ）、烧杯 200、500、2000mL）、锥形瓶（ 500、1000mL）、采样瓶。 四．培养基及染色剂的制备 1．乳糖蛋白胨培养液：将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节溶液 pH 为 7.2～7.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于试管中，于 121℃高压灭菌器中灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。 2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液： 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。 除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。 3．品红亚硫酸钠培养基： ①贮备培养基的制备：于 2000mL 烧杯中，先将 20～ 30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入 3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到 1000mL，调节溶液 pH 为 7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入 10g 乳糖，混匀，定量分装于 250mL 或 500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在 121℃灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。 ②平皿培养基的制备： 将上法制备的贮备培养基加热融化。 根据锥形瓶内培 养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的 5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌 试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠， 置于另一灭菌试管内， 加灭菌水少许使其 溶解，再置于沸水浴中煮沸 10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠 溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多） 。将 此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡） 。立即 将此培养基适量（约 15mL ）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内 备用，但保存时间不宜超过两周。 如培养基已由淡红色变成深红色， 则不能再用。 4．伊红美培养基： ①贮备培养基的制备：于 2000mL 烧杯中，先将 20～ 30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解。再家人 2.0g 邻酸二氢钾及 10g 蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至 1000mL，调节溶液 pH 值为 7.2～ 7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入 10g 乳糖，混匀后定量分装于 250mL 或 500mL 锥形瓶内，于 121℃ 高压灭菌 15min，贮于冷暗处备用。 第 1 页 共 4 页 ②平皿培养基的制备： 将上述制备的贮备培养基融化。 根据锥形瓶内培养基 的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的 2%伊红水溶液（ 0.4g 伊红溶于 20mL水中）和一定量已灭菌的 0.5%美蓝水溶液（ 0.065g 美蓝溶于 13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡） ，立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。 5．革兰氏染色剂： ①结晶紫染色液：将 20mL 结晶紫乙醇饱和溶液（称取 4～8g 结晶紫溶于100mL95%乙醇中）和 80mL 1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。 ②助染剂：将 1g 碘与 2g 碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至 300mL。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡 黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于 30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。 ③脱色剂： 95%乙醇。 ④复染剂：将 0.25g 沙黄加到 10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加 90mL蒸馏水。 五．测定步骤 1．生活饮用水： ①初发酵试验：在两个装有已灭菌的 50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管） ，以无菌操作各加入已充分混匀的水样 100mL。在 10 支装有已灭菌的 5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管） ，以无菌操作加入充分混匀的水样 10mL混匀后置于 37℃恒温箱内培养 24h。 ②平板分离： 上述各发酵管经培养 24h 后，将产酸、产气及只产酸的发酵管 分别接种于伊红